portur.top

  

Bästa artiklarna:

  
Main / Vad är hexarelinpeptid

Vad är hexarelinpeptid

Katarina G. Hexarelin HEX är en peptid GH-sekretagog med en stark förmåga att stimulera GH-utsöndring och nyligen rapporterade kardioskyddande åtgärder. Dess effekter i hjärnan är dock i stort sett okända, och syftet med den aktuella studien var att undersöka den potentiella skyddande effekten av HEX på centrala nervsystemet efter skada, liksom på caspase-3, Akt och extracellulär signalreglerad proteinkinas ERK-signalkaskader i en råttmodell av neonatal hypoxi-ischemi.

Hypoxisk-ischemisk förolämpning inducerades genom ensidig karotidligering och hypoxisk exponering 7. Hjärnskador kvantifierades vid fyra koronala nivåer och genom regional neuropatologisk poängsättning. Hjärnskador utvecklas inte akut under HI-förolämpningen utan utvecklas snarare under flera dagar sekundär hjärnskada, vilket öppnar ett fönster för möjligheter för terapeutisk intervention 3.

Tillväxtfaktorer skyddar neuroner från att dö under en mängd olika omständigheter in vitro 4 - 7. Det har också visats att flera trofiska faktorer, inklusive GH och IGF-I, har neuroskyddande egenskaper under sekundärfasen efter HI in vivo 8 - 12, även om de underliggande mekanismerna ännu inte är helt förstådda. Det har emellertid visats att aktivering av fosfatidylinositol-3-kinas PI3K-väg och nedströms fosforylering av kinas Akt pAkt medierar tillväxtfaktorinducerad neuronal överlevnad in vitro 13.

Kaspasberoende mekanismer verkar särskilt viktiga för celldöd i den omogna hjärnan 25 - 28, eftersom kaspas-3-hämmare minskar neonatal hjärnskada 29. Dessutom är neuroprotection, av både hjärnavledad neurotrofisk faktor 10 och IGF-I, kopplad till en reduktion av aktiveringen av caspase-3 19.

Aktivering av ERK har visats hämma apoptos inducerad av hypoxi 30, tillväxtfaktoruttag 31, väteperoxid 32 och kemoterapeutiska medel 33. Hexarelin HEX är en sex-aminosyra-peptid som tillhör en familj av syntetiska GH-sekretagoger GHS 35 som har en stark förmåga att frigöra GH från hypofysen och stimulera matintaget 36.

Ghrelin är den nyligen upptäckta endogena liganden till GHS-receptorn-la 37, 38. Förutom deras neuroendokrina aktivitet har ghrelin och syntetiska GHS visat sig vara hjärtskyddande 39, 40 och att hämma apoptos i kardiomyocyter och endotelceller genom aktivering av ERK och Akt-kinaser 41. Baserat på den kardioskyddande effekten och aktivering av överlevnadssignaleringsvägar i kardiomyocyter tog vi upp hypotesen att HEX skulle kunna vara neuroskyddande.

Vårt mål var att undersöka effekterna av HEX efter behandlingen på skador på centrala nervsystemet, aktivering av caspas-3 och intracellulär Akt och ERK-signalering i en råttmodell av neonatal HI. Ensidig HI inducerades i neonatala råttor såsom tidigare beskrivits 42, 43. Kortfattat, 7-d-gamla [postnatal dag PND 7] Wistar-råttor bedövades med enfluran 3. Den vänstra gemensamma halspulsåren skars mellan två prolen-suturer 6—0. Efter anestesi och operation fick djuren återhämta sig i 60 minuter.

De exponerades därefter för 60 min hypoxi i en fuktad kammare vid 36 ° C med 7. Efter hypoxi. Injektioner riktades mot vänster kammare mot 1. Djur var under anestesi enfluran, 1.

Vid PND 10 perfunderades djuren intrakardiellt med 0. Hjärnor avlägsnades från skallen och nedsänktes vid 4 ° C under 24 timmar och dehydratiserades därefter och inbäddades i paraffin. Louis, MO 45. Immunreaktivitet visualiserades med användning av diaminobensidin DAB såsom beskrivs nedan. Hjärnskador utvärderades med användning av båda areamätningarna av vävnadsförlust på fyra anatomiska nivåer och genom neuropatologisk poängsättning. Intakta neuroner dendriter och soma uttrycker MAP-2 och infarkt i grå substans är associerat med en tydlig förlust av MAP-2 immunreaktivitet.

MAP-2-positiva områden i de ipsilaterala och kontralaterala halvklotet skissades av en observatör som var blind för studiegrupperna och beräkningar gjordes med hjälp av programvaruversionen för Olympus Micro Image-analys 4. Hjärnvävnadsförlust beräknades genom att subtrahera MAP-2-positivt området av den ipsilaterala halvklotet från den kontralaterala halvklotet och uttrycktes som procentandel av den kontralaterala halvklotet som tidigare beskrivits 46.

Regional hjärnskada utvärderades också av en observatör som var blindad för studiegrupperna med hjälp av ett neuropatologiskt poängsystem där skada i cortex graderades från 0—4 med 0 som ingen observerbar skada och 4 var sammanflytande infarkt som omfattade större delen av halvklotet. Djur dödades 24 timmar efter HI vid PND 8, och cytosolfraktioner bereddes för mätning av caspas-3-aktivitet, se nedan.

Santa Cruz, Kalifornien. Temecula, CA. Antikropparna mot fosfo-Akt Ser 473 kanin polyklonalt nr. Beverly, MA. Anti-GSK3 mus monoklonalt nr. Lake Placid, NY. Alla sekundära antikroppar var från Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA. Inkubation med primär antikropp, anti-fosfo-Akt Ser 473 peptid nr. Sektioner tvättades i PBS och inkuberades med biotinylerad sekundär antikropp under 1 timme, följt av inhibering av endogent peroxidas 0. Immunreaktivitet visualiserades med användning av DABO.

Antikropparnas specificitet testades genom utelämnande av den primära antikroppen. Tidigare studier i neuronal murin vävnad har bekräftat antikroppsspecificitet med förabsorbering med användning av fosfo-Akt Ser 473 peptid 48. För att avslöja den immunhistokemiska reaktionen, ett biotinfritt detektionssystem EnVision; DakoCytomation användes och DAB användes som kromogen.

Paraffininbäddad vävnad från hypofysen från råtta och från råttlever fungerade som positiva kontroller för GH- och IGF-I-experiment. Utelämnande av de primära antikropparna på parallella sektioner användes som negativ kontroll. Djur bedövades djupt genom ip-injektion av 0. Före immunhistokemisk färgning avparaffiniserades sektioner och kokades i citronsyrabuffert 0. Sektioner inkuberades med följande antikroppar: Efter tvättning och med tvättprocedurer däremellan inkuberades sektioner under 1 timme vid rumstemperatur för vart och ett av följande steg med efterföljande antikroppar: Efter tvättning monterades sektioner med användning av Vectashield monteringsmedium.

Sektioner analyserades under ett Olympus BX40 fluorescensmikroskop utrustat med en Olympus DP50-kyld digitalkamera. Immunkomplex fälldes ut genom tillsats av protein A-Sepharose och inkubering i 2 timmar vid 4 C. Hjärnan skördades snabbt, halvklotet delades och cortex dissekerades ut.

Varje prov homogeniserades omedelbart i iskall homogeniseringsbuffert 15 m Tris-HCl, pH 7. Proteininnehållet kvantifierades med användning av metoden som presenterades av Whitaker och Granum 1980 49, anpassad för mikroplattor. Membran blockerades i 30 m m Tris-Hcl pH 7. Blottar tvättades tre gånger med TBS-T och inkuberades med lämpligt sekundärt peroxidas-konjugat utspätt i blockerande buffert. Immunreaktiva band kvantifierades med hjälp av Image Gauge-programvaruversion 3.

Varje proteinband på Western blotting härstammar från ett djur. Varje immunoblot utfördes med användning av proverna från tre till fyra djur i varje experimentgrupp.

Membran avlägsnades för reprobning med nya antikroppar genom att de inkuberades i strippningsbuffert 62. Prover av cytosolfraktion blandades med extraktionsbuffert 50 mm Tris-HCl, pH 7. Klyvning av substratet mättes vid 37 ° C med användning av Spectramax Gemini mikroplattfluorometer Molekylär Enheter, Sunnyvale, CA, med en excitationsvåglängd på 380 nm och en emissionsvåglängd på 460 nm.

Nedbrytningen följdes med intervaller på 2 minuter under 2 timmar och V-max beräknades från hela linjär del av kurvan. Standardkurvor med AMC i lämplig buffert användes för att uttrycka data i picomoler av AMC 7-amino-4-metyl-kumarin bildad per minut och per milligram protein. I alla fall motsvarar n antalet djur.

Areamätningar som jämför den skadade halvklotet med den oskadade halvklotet visade en signifikant minskning av skadorna på alla fyra nivåerna i hjärnan hos de HEX-behandlade djuren jämfört med kontrollerna. Fig. När man använder ett neuropatologiskt poängsystem minskades hjärnskador i hjärnbarken HEX : Det fanns inga skillnader i kroppstemperatur, mortalitet eller kroppsviktdata som inte visas mellan de två grupperna.

Dessutom fanns inga signifikanta skillnader i hjärnskada mellan manliga och kvinnliga djurdata som inte visas. HEX minskar HI hjärnskada. Vävnadsförlust beräknades som MAP-2-områdesunderskott i den ipsilaterala halvklotet, uttryckt som procent av den högra oskadade halvklotet.

B, regional morfologisk analys med ett neuropatologiskt poängsystem för hjärnskada i hjärnbark, hippocampus, thalamus och striatum. Fosforylering av Akt efter HI. Varje band representerar ett prov från ett djur. Western blot användes också för att kvantifiera pERK. En fluorometrisk analys användes för att kvantifiera caspas-3-liknande aktivitet. HEX minskar caspase-3-liknande aktivitet. GH-antikroppsspecificitet demonstrerades genom intensiv reaktivitet i enstaka celler av hypofys från råtta. IGF-I-immunreaktivitet hittades i råttleverceller Fig.

GH-antikroppsspecificitet demonstreras av intensiv reaktivitet i enstaka celler i hypofysen hos råtta A. Negativa immunhistokemiska resultat observeras i hjärnneuroner i perilesionala områden C och E.

IGF-I-immunreaktivitet finns i råttleverceller B och hjärnneuroner i både kontralaterala D- och ipsilaterala, perilesionala områden F, utan signifikant skillnad i intensitet. C, E och F, Perilesional-områden med den ischemiska lesionen representerad längst ner till vänster. Såsom visas i fig. A kvantifierades bandintensiteterna, normaliserade till IGF-IR, genom densitometrisk analys och rapporterades som procent av fordonskontrollen.

Band är från två olika och representativa geler av totalt fyra oberoende experiment, där proteinprover från två vehikel- och två HEX-behandlade råttor kördes på samma gel. De viktigaste resultaten i denna studie är: HEX minskade signifikant skada utvärderad både genom att mäta vävnadsförlust vid fyra nivåer i hjärnan och genom regional neuropatologisk poängsättning.

Betydande skydd sågs i cortex, hippocampus och thalamus men inte i striatum. Det senare alternativet är mer troligt eftersom det inte fanns någon detekterbar immunfärgning av neuronal GH på hjärnsektioner från varken HEX- eller vehikelbehandlade HI-råttor.

En nyligen genomförd studie av administrering av en annan GHS, GH-frisättande peptid 6, till vuxna råttor under fysiologiska förhållanden har visat ökade IGF-I-mRNA-nivåer i hypotalamus, cerebellum och hippocampus men inte i cortex 52. Således kan det antas att de neuroskyddseffekter som rapporterats i föreliggande studie medierades av ökat uttryck av IGF-I.

(с) 2019 portur.top